sHLA-G

今日、sHLA-G5をトランスフェクトしたHela細胞を培養して得られた上清のsHLA-G濃度をELISAキットで測定してみました。
2つのT75フラスコから約20mlの上清が得られましたが、その濃度は約2000Unit/mlで、だいたい0.8~1.0μg/mlに相当するようです。思った以上の濃度が得られて良かったです。来週、500Unit/mlから段階希釈してB細胞を刺激し、48時間後の増殖反応をトリチウムを使って測定してみます。

今週はB細胞をIL-21、IL-4、IL-10などのサイトカインとともに培養しています。2日おき程度に上清と細胞を回収して経時的な変化を解析してみます。

IgG

昨日、培養B細胞の上清のIgG濃度をELISAで測定してみました。
予想に反してBCR刺激を加えた群のIgG産生が低く、IL-4よりもIL-21の方がIgG産生に強く影響しました。
CD40刺激＋IL-21でのIgG濃度が最も高く、約700ng/mlでした。
今日は生存している細胞の増殖能をトリチウムの取り込みによって測定しましたが、増殖能はほとんど０でした。
次回の培養実験ではもう少し条件を工夫してIgGの産生量を増やしてみます。

Hela細胞

　今日はドイツの研究者から供与していただいたHLA-G5の遺伝子を形質移入したHela細胞の培養に取りかかりました。Mock細胞と一緒に液体窒素に保存された細胞を37℃の水槽で一気に解凍し、培養液の中に放り込んで保存液のストレスから細胞を開放してあげます。遠心後に培養液で再浮遊して細胞数を数えてみると、HLA-G5遺伝子導入細胞は1,200,000個あり、そのままT75と呼ばれる培養フラスコに移し替えてインキュベーターに入れました。
　HLA-G5は可溶性の蛋白質なので、培養上清にどんどん分泌されます。上清中の蛋白質を精製して実験に用いると効率がいいと思うのですが、タグもついていないので精製は非常に困難なようです。しかも、これまでの実験から培養上清でも十分に作用することが分かっているので、今回もそのまま上清だけを集めます。目的はHLA-G5によるB細胞の活性化の解析です。
　膜型のHLA-G1遺伝子を導入したLCL細胞も液体窒素に眠っているので、可溶性の蛋白の実験のあとはHLA-G1を発現したLCL細胞との共培養におけるB細胞の活性化を解析します。

　明日、明後日はIL-4とIL-21で刺激したB細胞の培養上清の回収日です。うまくIgGの産生が誘導されていることを祈るばかりです。来週ELISAで確認します。

培養

昨日から風邪を引いてしまいました。
熱はないようですが、咳と痰が出て節々が痛みます。
そんな中、今日から新たな実験に取りかかりました。
　
まずは金曜日に継代しておいたCD40L-transfected線維芽細胞に放射線を当てて増殖能を壊します。それを96穴の培養プレートに適度な細胞密度で蒔いておきます。
次に自分の腕から血液を120mlほどをEDTA入試験管に採取します。Ficollを用いて比重遠心法でPBMCを採取し、MACSセルソーターを用いてCD19陽性細胞だけを集めます。今日は風邪気味だったせいか217M個も集められました。
今回は、以下の条件での培養において産生される免疫グロブリンを解析します。
１．無刺激のB細胞
２．+BCR刺激
３．+CD40L
４．+BCR +CD40L
５．上記1.~4. +IL-4
６．上記1.~4. +IL-21
７．上記1.~4. +IL-4 +IL-21
BCRの刺激はIgG抗体+IgM抗体の刺激を24時間加えるため、今日はBCRの刺激を加えないB細胞だけを線維芽細胞と共培養し、BCR刺激を行っているB細胞は明日線維芽細胞のプレートに移します。
解析は7日間と11日間の両方で行う予定です。

見学

ラボでは患者由来の末梢血リンパ球を用いた免疫応答の解析、正常人末梢血リンパ球を用いてのB細胞の免疫応答の解析、患者血清に含まれる自己抗体の解析などが同時に進行していますが、当面B細胞の培養に専念することにしました。
　
今日は患者末梢血からのFicollを用いたPBMCの分離、DMSOを用いた凍結保存までの行程を一通り見ていました。効率よく約3時間で処理されるのに関心しました。当然なのかもしれませんが、ルーチンワークに関しては詳細な独自マニュアルがあり、例外なく従っているため保存状態や細胞密度などもきちんと一定になっています。凍結チューブのラベルも細かく3行で印字され、コード化してコンピュータで管理しています。
　
午後からはFACSの解析を見ていました。多くのメンバーがFACSで解析を行うため、連日予定表が埋まっています。今日の解析はCSFEでラベルしたT細胞の変化とサイトカイン産生の関連をみたもので、解釈は難しいものの、ユニークな解析でした。